مجله بيوتكنولوژي كشاورزي علمي-پژوهشي و ISC بررسی بیان ژنهای کلیدی در انتقال مجدد فروکتان گندم و برخی صفات فیزیولوژیک طی تنش شوری انتهای فصل ماهرخ شربتخواری 1 زهرا سادات شبر 2 سراله گالشی 3 افشین سلطانی 4 بابک ناخدا 5 1 دانشجوي دكتراي گروه زراعت دانشكده توليد گياهي دانشگاه علوم كشاورزي ومنابع طبيعي گرگان 2 5 استادیار بخش فيزیولوژي مولكولي پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي ایران 34 استاد گروه زراعت دانشكده توليد گياهي دانشگاه علوم كشاورزي ومنابع طبيعي گرگان چکیده تاریخ دریافت: 1332/73/70 تاریخ پذیرش: 1333 /70/21 انتقال مجدد قندهاي محلول ساقه گندم بهویژه فروكتان در شرایط تنش اهميت زیادي در پر نمودن دانه و توليد عملكرد دارد. بهمنظور مطالعه اثر شوري بر بيان ژنهاي كليدي دخيل در این سازوكار ارقام متحمل بم و حساس قدس از نظر بيان ژنهاي 1-sst و 6-sft دخيل در بيوسنتز فروكتان ژنهاي ivr بهترتيب دخيل در تجزیه فروكتان و ساكارز و ژن sut1 دخيل در انتقال ساكارز بهروش و Real-Time PCR شوري بررسي شدند. آزمایش در گلخانه بر پایه طرح كامال تصادفي بهروش فاكتوریل در سه تكرار و اعمال از شروع گلدهي آب آبياري با با هدایت الكتریكي 15 dsm -1 بههمراه تيمار شاهد انجام شد. نمونهبرداري ساقه براي اندازهگيري فروكتان در پنج نوبت بهفاصله یک هفته طي پر شدن دانه نمونهبرداري براي اندازهگيري محتواي نسبي آب و پرولين از برگ و براي آزمایشات مولكولي از ساقه و بذر طي یک نوبت در 21 روز پس از گلدهي انجام شد. مقدار انتقال مجدد از تفاضل حداكثر و حداقل فروكتان محاسبه گردید. نتایج نشان داد اثر شوري بر محتواي نسبي آب و پرولين معنيدار بود. طي شوري القاي انتقال مجدد و افزایش معنيدار بيان ژنهاي 1-sst و ivr ساقه و sut1 بذر در بم اتفاق افتاد. بيان ژنهاي ivr و با انتقال مجدد فروكتان در شوري همبستگي مثبت و معنيدار داشت. براساس نتایج رقم بم با توانایي باالتر در تجزیه و انتقال فروكتان طي پر شدن دانه بهكمک تنظيم بيان ژنهاي درگير در این مسير در استفاده از ذخایر ساقه طي شوري موفقتر بوده و عملكرد باالتري توليد كرد. واژههای کلیدی: شوري انتهاي فصل انتقال مجدد فروكتان بيان ژن. E-mail: shobbar@abrii.ac.ir نویسنده مسئول: زهرا سادات شبر تلفن: 323-32533533
شربتخواری و همکاران 3131 مقدمه تحت شرایط تنش طيفي از پاسخها در كل گياه و در سطوح سلولي و مولكولي مشاهده ميشود )Hasegawa et al., 2000( و الگوي بيان بسياري از ژنها از جمله ژنهاي مربوط به پروتئينهاي درگير در مسيرهاي سيگنالي و پروتئينهاي عملكردي در پاسخ به تنش تغيير ميكند. پاسخهاي گياهي در این شرایط به طور كلي منجر به حفظ ثبات سم زدایي و تداوم رشد گياه ميگردد.)Salekdeh et al., 2002( در مناطق خشک و نيمهخشک با طي شدن رشد رویشي گياه با كاهش بارندگي مواجه شده فراواني آبياري كاهش یافته و ميزان تبخير و تعرق گياه با افزایش دما افزایش ميیابد. این عوامل باعث تجمع نمک در محلول خاک شده و ميتواند تنش شوري را در مرحله رشد زایشي گياه به وجود بياورد 1993( al.,.)karim et به دليل تنش اسمزي و یوني ناشي از شوري گياه از سازوكارهاي مختلفي نظير تنظيم اسمزي و كدهبندي سدیم و كلر در واكوئل براي تداوم جذب آب و حفظ كارایي فتوسنتز استفاده ميكند.)Jenks, 2007( تنظيم اسمزي تحت تاثير عوامل محيطي بوده و باعث افزایش انواع اسموليتها مانند كربوهيدراتهاي محلول شامل فروكتانها ساكارز گلوكز و فروكتوز طي شوري ميگردد و در بين ارقام گندم داراي تنوع ژنتيكي است Blum, 1998; Kerepesi and Galiba, 2000; (.)Ehdaie et al., 2006 تجمع هر یک از اسموليتها مستلزم افزایش بيان ژنهاي مربوط به آنزیمهاي درگير در مسيرهاي متابوليكي این تركيبات ميباشد. فروكتانها كه اليگو و پلي ساكاریدهاي خطي یا منشعب بر پایه فروكتوز مي باشند و از ساكارز مشتق شده اند بيشترین مقدار قند محلول كل ساقه گندم را تشكيل ميدهد. لذا مطالعات زیادي در مورد فعاليت آنزیمهاي مسير متابوليكي فروكتانها و ژنهاي دخيل در این فرایند در شرایط آبياري و تنش خشكي انجام شده است.)Xue et al., 2008( مهمترین ژنهایي كه در مسير بيوسنتز فروكتان دخالت دارند شامل ژن 1-sst فروكتوزیل ترانسفراز ژن مربوط به آنزیم 1-6-sft 3 -فروكتوزیل ترانسفراز و ژن مربوط به آنزیم مربوط به 1-fft آنزیم 1 و 2 - بتافروكتان 1 -فروكتوزیل ترانسفراز ميباشند 2003( al.,.)van den Ende et افزایش توليد فروكتان با هدف افزایش تحمل تنشهاي غير زیستي طي دو دهه اخير مورد توجه محققين بوده است. افزایش بيان ژنهاي بيوسنتزي فروكتان و تجمع آن در تنشهاي خشكي و سرما Kawakami and Yoshida, Xue et al., 2008( )2005; كه اولين آثار منفي آنها برگياه ناشي از تنش اسمزي است به گياه كمک ميكند تا با جذب آب و تداوم فعاليتهاي حياتي براي مقابله با افزایش شدت تنش راهبردهاي پيچيده تري را سازماندهي كند )Hisano et al., 2004( ولي در رابطه با تنظيم بيان این ژنها تحت تنش شوري در انتهاي فصل رشد تاكنون مطالعهاي 67
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131( انجام نشده است. در دوره پر شدن دانهها با افزایش بيان ژنهاي درگير در هيدروليز فروكتان 6-feh و مانند مربوط به آنزیمهاي 1- اگزوهيدروالز و 3 -اگزوهيدروالز و تجزیه فروكتان به فروكتوز و ساكارز سازوكار انتقال مجدد ذخایر كربوهيدرات محلول ساقه فعال ميگردد سه نسخه ژن.)Xue et al., 2008( w2 w1 و داراي w3 است كه هر یک از آنها روي كروموزوم 3 به ترتيب در ژنومهاي D A و B گندم قرار دارند. ميزان بيان آنها بين و درون ژنوتيپهاي گندم در تيمار تنش آبي متفاوت گزارش شده است. به دليل بيان باالتر ژن w3 به ميزان 13 تا 23 برابر نسبت به دو رونوشت دیگر و همبستگي باالي آن با مقدار فروكتان این رونوشت به عنوان ژن كليدي در تجزیه فروكتان در گندم معرفي شده است )2009 al.,.)zhang et تحت تنش آبي بيان ژن گلدهي به حداكثر ميرسد ( طي 23 تا 22 روز پس از Wardlaw and.)zhang et al., 2009; Willenbrink, 2000 استفاده موثر از قندها در گياه بستگي به فعاليت آنزیمهاي تجزیه كننده ساكارز دارد كه تحت تاثير ژنهاي پاسخده به قند بيان ميشوند ( 1996(. آنزیم اینورتاز واكوئلي Koch, در كنترل )ivr( تركيب قندها در اندامهاي مخزن و نيز در پاسخ به تنشهاي غير زیستي و تنظيم اسمزي اهميت دارد. افزایش بيان ژن اینورتاز واكوئلي طي پر شدن دانه و به دنبال تجزیه فروكتان باعث هيدروليز ساكارز و توليد فروكتوز و گلوكز گردیده )Yang et al., 2004( و بيشترین بيان آن طي خشكي از 21 تا 32 روز پس از گلدهي گزارش شده است ; Joudi Yang et al., 2004(.)et al., 2012 چرخه مداوم تجزیه و ساخت ساكارز از ویژگيهاي مهم متابوليسم ساكارز در بسياري از سيستمهاي گياهي است. ساكارز مهمترین كربوهيدرات انتقال یابنده در مسيرهاي طوالني است و جابجایي آن در عرض غشا از دو مسير حاملين با ميل تركيبي باال و ظرفيت پایين شامل زیرخانواده SUT1 و ناقلهاي با ميل تركيبي پایين و ظرفيت باال شامل دو زیرخانواده و SUT2 SUT4 صورت ميگيرد. این سه زیر خانواده از نظر ساختار ژن و پروتئين سينتيک انتقال قند و محل استقرار در سلول متفاوتند. ناقلين ساكارز در گندم در زیرخانواده قرار SUT2 داشته همبر )سيمپورتر( ساكارز/پروتون بوده و با قرار گرفتن در ساختار غشاي پالسمایي در بارگيري آوند آبكش در بافت منبع و انتقال ساكارز در مسيرهاي طوالني و بارگذاري در بافت مخزن اهميت دارند و فعاليت آنها در سطح بيان ژن تنظيم ميگردد ژن sut1.)shiratake, 2007( در گندم هگزاپلوئيد داراي سه نسخه sut1a, 1B, 1D است كه هریک از آنها در كروموزوم شماره به ترتيب در ژنومهاي B A و D دارند. این رونوشتها از نظر طول منطقه UTR 3 وجود كه رونویسي شده ولي ترجمه نميشود متفاوتند ولي از نظر توالي پروتئين %82 شباهت دارند و به مقدار مشابهي در برگ ساقه و دانه بيان ميشوند ; Aoki et al., Aoki et al., 2004( 66
شربتخواری و همکاران 3131.)2007 بر اساس مطالعات انجام شده تاكنون تحقيقي در رابطه با تاثير شوري انتهاي فصل بر تغييرات ذخایر قندي ساقه گندم طي پر شدن دانه و بررسي بيان ژنهاي دخيل صورت نگرفته است. در این پژوهش با مطالعه تغييرات بيان ژنهاي دخيل در انتقال مجدد فروكتان در ژنوتيپهاي حساس و متحمل به شوري نقش آنها در توانمند ساختن گياه براي استفاده از ذخایر ساقه در شوري انتهاي فصل مورد ارزیابي قرار ميگيرد. مواد و روش ها کشت گیاه و اعمال تنش دو رقم گندم شامل بم )متحمل به شوري با انتقال مجدد باال( و قدس )حساس به شوري با انتقال مجدد پایين( از نظر چگونگي بيان ژنهاي كليدي دخيل در بيوسنتز تجزیه و انتقال فروكتان مورد بررسي و مقایسه قرار گرفتند. كشت در گلخانه با استفاده از طرح كامال تصادفي در قالب فاكتوریل در سه تكرار انجام شد. فاكتورها شامل رقم و تيمار شوري هر كدام در دو سطح بودند. تيمار شوري ازطریق انحالل كلرید سدیم در آب آبياري با هدایت الكتریكي 15 دسيزیمنس بر متر از مرحله شروع گلدهي اعمال شد. هدایت الكتریكي خاک از طریق آب زهكش گلدان به طور هفتگي كنترل شد. اندازهگیری عملکرد و صفات فیزیولوژیک عملكرد دانه با محتواي رطوبتي %13 بر حسب گرم در بوته محاسبه گردید. محتواي نسبي آب برگ )RWC( بر روي دومين برگ كامال رشد یافته از باال )1998 Sethi, )Dhanda and و محتواي پرولين برگ با استفاده از اسپكتروفوتومتري در طول موج اندازهگيري شد 523 نانومتر.)Bates et al., 1973( اندازهگيري قند نمونهبرداري از ساقه گلدهي براي از زمان به فاصله هفت روز طي پنج نوبت انجام و پس از استخراج به روش ژو و همكاران Xue ( )et al., 2008 )گلوكز+فروكتوز( و فروكتان اندازهگيري شد محتواي قندهاي هگزوز با دستگاه HPLC.)Ehdaie et al 2006( انتقال مجدد فروكتان ساقه از تفاضل حداكثر و حداقل محتواي فروكتان در طول پر شدن دانه محاسبه گردید. آزمایشات مولکولی )با نمونهبرداري براي اندازهگيري بيان ژن در زمان 21 روز پس از گلدهي از بافت ساقه و بذر 3 مشاهده در هر تكرار( صورت گرفت و داخل نيتروژن مایع به فریزر سانتيگراد منتقل گردید. برداري 23- درجه دو دليل اصلي براي انتخاب زمان نمونه شامل رسيدن شوري خاک به سطح 15 دسيزیمنس بر متر و بررسي تاثير شوري بر بيان ژنهاي مورد مطالعه در زمان اوج مرحله پر شدن و باالترین سرعت رشد دانه ميباشد. 67
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131( طراحی آغازگر: به منظور بررسي الگوي )RNase-free DNase از شركت Promega بيان پنج ژن دخيل در انتقال مجدد فروكتان ساقه شامل ivr 6-sft,1-sst خانهدار فسفوگلوكونودهيدروژناز sut1 و ) 1 phg( و ژن كه بر اساس مطالعات انجام شده بيان آن طي دوره زایشي گندم در بافتهاي مختلف و در شرایط تنش داراي ثبات نسبي باالیي بود Paolacci et ( )al., 2009 به روش Real time PCR آغازگرهاي اختصاصي با استفاده از نرم افزار OLIGO ver 5 و بر اساس تواليهاي اختصاصي طراحي شدند به طوري كه حداقل پرایمر برگشتي بر روي توالي 3'UTR قرار داشت )جدول 1(. در مورد ژن sut1 تفكيک رونوشتهاي طراحي دو آغازگر متفاوت براي A و B امكانپذیر نبود لذا با جفت آغازگر طراحي شده هر دو رونوشت مورد تكثير قرار گرفتند. تكثير همزمان این دو رونوشت در تحقيقات دیگر نيز صورت گرفته است.)Aoki et al., 2004( بيان این ژن عالوه بر ساقه در بذر نيز اندازهگيري شد. استخراج : RNA 133 ميليگرم از بافت تر گياه با كمک نيتروژن مایع در هاون سایيده و با استفاده از ترایزول ( Invitrogen, life RNA )technology كل استخراج شد.)Chomczynski & Sacchi, 1987( به منظور اطمينان از كيفيت مطلوب و تعيين غلظت نمونهها با استفاده از اسپكتروفوتومتري و الكتروفورز مورد بررسي قرار گرفتند. حذف آلودگي DNA ژنومي با كيت انجام گرفت. جهت اطمينان از حذف آلودگي احتمالي DNA واكنشPCR با RNA DNase روش با استفاده از آغازگر ژن سنتز phg cdna Real time PCR با استفاده از كيت تيمار شده انجام شد. و بررسی نسبی بیان ژن با : واكنش سنتز cdna BIO-RAD, iscript cdna synthesis kit استفاده از كيت و واكنش Real time PCR )BIO-RAD, iq Syber Green( Supermix با انجام شد. به منظور تعيين كارایي )E( هر جفت آغازگر در واكنش Real Time PCR پنج سري رقت با دو تكرار از مخلوط cdna تهيه و منحني استاندارد رسم شد و پس از تعيين شيب خط كارایي هر جفت آغازگر محاسبه گردید)فرمول 1 ( E=( 1 - Efficiency.)Pfaffi, 2001( )فرمول 2001()2 )Pfaffi, فرمول )1( )*100 ميزان بيان ژن با روش adjusted ΔΔCt محاسبه شد. همه دادهها با ژن خانهدار فسفوگلوكونات دهيدروژناز كنترل داخلي (phg) )Paolacci et al., 2009( به عنوان نرمال و ميزان بيان ژن در تنشهاي مختلف نسبت به شاهد رقم متحمل بم سنجيده شد. فرمول )2( افزار تجزیه و تحليل دادهها با استفاده از نرم SAS و با استفاده از رویه GLM و مقایسه ميانگينها با استفاده از آزمون 3/35 صورت گرفت. در سطح LSD RQ1 ( DNase1 1 Similar to phosphogluconate dehydrogenase 67
شربتخواری و همکاران 3131 جدول 1 - فهرست آغازگرهای مورد استفاده در بررسی بیان ژنهای دخیل در متابولیسم و انتقال مجدد فروکتان. طول Table 1- List of primer pairs used in expression analysis of genes involved in fructan metabolism and remobilization. محصول دماي اتصال آغازگر برگشتي آغازگر رو به جلو شماره دسترسي نام ژن Gene Accession No. Forward Reverse Annealing )c( Temp. 1-sst AB029888.1 GCGACTCTGCCTATCACTTC CATAGCCCTGTCATCAACAC 62 88 Product Length )bp( 6-sft AB029887.1 CGATCACTCGTATGTTCAATG CACGGATAGATGTTTCTGTTC 61 118 125 AJ508387.1 AATGTGGAGAAGGGTTGGAG GGCTATTTTCTTTCCTGCTG 61 w3 ivr AF069309.1 ACGATGCCTCAGCCGCCTTG GAGGGAGGAAGTCGCCGATC 62 122 sut1a AF408842.1 TATTCCTGCTGCCCAAGATC CTGCTCTACGGAGTCCTTAG 60 159 sut1b AF408843.1 TATTCCTGCTGCCCAAGATC CTGCTCTACGGAGTCCTTAG 60 145 phg Ta30797.1 ACTGGTGGTTCAGGCTAAAG TGGGTTGGACGAACTACAAG 62 92 و بحث نتایج عملکرد دانه و صفات فیزیولوژیک بر بر اساس نتایج تجزیه واریانس محتواي انتقال مجدد فروكتان رطوبت نسبي محتواي اثر شوري و پرولين و اثر ژنوتيپ بر عملكرد دانه حداكثر محتواي هگزوزها و محتواي پرولين معنيدار بود)جدول 2 (. اثر متقابل شوري و ژنوتيپ نيز بر تمام صفات غير از مقدار هگزوزها معنيدار بود كه نشان داد دو رقم مورد بررسي تحت تنش شوري به شيوه متفاوتي پاسخ دادند. مقایسه ارقام در هر یک از سطوح شوري نشان داد رقم قدس طي شوري به طور قابل توجهي عملكرد دانه كمتري نسبت به بم داشت )جدول 3 (. حفظ محتواي آب نسبي برگ در بم همزمان با افزایش معنيدار محتواي پرولين )جدول 3 ( و قندهاي هگزوز )شكل b ( حاكي از واكنش این رقم در پاسخ به شوري براي تنظيم اسمزي است. انتقال مجدد فروكتان نيز در ارقام بم و قدس طي شوري بهترتيب افزایش و كاهش یافت )جدول 3 (. به نظر مي رسد تنش شوري انتهاي فصل اعمال شده تأثيري بر محتواي آب برگ نگذاشته و گياه قادر به تداوم فتوسنتز خود بوده و از طرفي این تنش مالیم منجر به القاي سازوكار انتقال مجدد در رقم متحمل بم گردیده و در این شرایط بذور در حال پر شدن با دو منبع فتوسنتز جاري و انتقال مجدد ذخایر ساقه تغذیه شدند كه ميتواند باعث افزایش وزن دانه در بوته شده و عملكرد نهایي را افزایش دهد. 78
جدول مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131( تجزیه واریانس صفات محتوای آب نسبی محتوای پرولین حداکثر محتوای هگزوزها )گلوکز+فروکتوز( انتقال مجدد فروکتان و عملکرد دانه برای ارقام بم و قدس در سطوح شوری. Table 2- Analysis of variance of relative water content (RWC), proline content, hexoses content, fructan remobilization (Fructan Rem.) and grain yield for Bam and Ghods varieties at salt levels. ميانگين مربعات df Mean of square -2 عملكرد انتقال مجدد فروكتان محتواي هگزوزها پرولين محتواي آب نسبي RWC درجه آزادي منبع تغييرات SOV ژنوتیپ Genotype(G) شوری Salinity(S) ژنوتیپ شوری )S G( خطاError 1 1 1 8 17.5 ns 89.1 102.7 7.0 Prolin 0.44 0.13 0.34 0.003 Hexoses content 164.4 2.9 ns 0.117 ns 0.36 Fructan Rem. 3.9 ns 61.8 * 566.4 10.7 Yield 0.001 1.302 ns 0.117 0.001 Non-significant ns, Significant at P<0.01 ns معنی داری در سطح 7/71 غیر معنیدار جدول 3- مقایسه میانگین عملکرد دانه )گرم در بوته( محتوای آب نسبی )%( محتوای پرولین انتقال مجدد فروکتان و محتوای هگزوزها )میلیگرم بر گرم(. Table 3- Mean comparison of grain yield (g per plant), RWC (%), prolin content (mgg - 1 ), fructan remobilization (mgg -1 ) and hexoses content (mgg -1 ). محتواي هگزوزها انتقال مجدد فروكتان پرولين عملكرد محتواي آب نسبي ژنوتيپ Genotype بم) Bam ( قدس) Ghods ( RWC N S 84.0 a 84.6 a 81.3 a 77.1 b Yield N S 0.73 b 0.83 a 0.86 a 0.73 b Prolin N S 0.10 b 0.75 a 0.18 a 0.23 b Fructan Rem. N S 26.4 b 33.0 a 37.7 a 28.0 b Hexoses content N S 4.5 a 11.8 a 3.4 a 3.3 b مقایسه میانگین ها در سطح 7/75 با استفاده از آزمون حداقل اختالف معنیدار )LSD( انجام شده است. در هر ستون حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی دار است. Mean comparison at P<0.05 using Least Significant Difference (LSD) test. Similar characters in each column shows non-significant difference. مقایسه بیان ژن های مورد بررسی تحت 6-sft تیمارهای شاهد و شوری نتایج تجزیه واریانس دادههاي بيان ژن نشان داد تحت تنش شوري انتهاي فصل غير از ژن كه اثر ساده شوري بر آن معنيدار نبود بيان سایر ژنهاي مورد بررسي در زمان 21 روز پس از گلدهي به طور معنيداري تحت تاثير قرار گرفت )جدول (. اثرات متقابل معنيدار بيانگر 78
شربتخواری و همکاران 3131 پاسخدهي متفاوت ارقام در مواجهه با شوري بود و نشان داد بيان ژنهاي مورد بررسي در ساقه دو رقم به طور متفاوتي تحت تاثير شوري قرار گرفتهاند. بررسی بیان ژن 1-sst مربوط به آنزیم ساکارز-ساکارز 1- فروکتوزیل ترانسفراز: ميزان بيان ژن 1-sst در ساقه در پاسخ به شوري نسبت به حالت نرمال در رقم بم به ميزان 3/1 برابر و در رقم قدس به ميزان 2/2 برابر افزایش یافت )شكل 1 ( بيان این ژن در ساقه گندم طي تنش خشكي انتهاي فصل در شروع گرده افشاني افزایش یافت )2008 al., )Xue et ولي در مورد چگونگي بيان آن در مرحله پر شدن دانه گندم مطالعهاي انجام نشده است. بررسي انجام شده بر روي فعاليت آنزیم 1-sst ساقه گندم طي تنش خشكي انتهاي فصل نشان داد فعاليت آنزیم با شروع تنش روند كاهشي پيدا كرد Yang et al., ( 2004(. به نظر ميرسد طي تنش شوري انتهاي فصل افزایش بيان ژن 1-sst در روز 21 پس از گلدهي در القاي تنظيم اسمزي دخالت داشته باشد. جدول 4- تجزیه واریانس بیان نسبی ژنهای مورد بررسی تحت تنش شوری انتهای فصل. Table 4- Analysis of variance for expression of the studied genes under terminal salinity. ميانگين مربعات Mean of squere منبع تغييرات SOV درجه آزادي df 1-sst stem 6-sft stem stem ivrstem sut 1 stem sut seed 5.35 1 ژنوتیپ ns ns 1.47 2.0 1.14 0.08 0.00 Salinity(S) 1 شوری 19.8 ns 0.21 1.1 41.4 0.4 1.02 * معنی داری در سطح * * 3.9 1 ژنوتیپ شوري S G ns 0.16 2.0 15.6 0.3 0.1 8 3.8 0.39 0.8 7.3 0.05 0.27 خطاError ns 7/75 معنی داری در سطح 7/71 غیر معنیدار Non-significant ns, Significant at P<0.01 Significant at P<0.05 * 78
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131( میانگین مقایسه شکل 1 - استفاده از آزمون.LSD بیان ژن 1-sst نسبت به شاهد رقم متحمل بم 21 در روز پس از گلدهی با Figure 2- Mean comparison of 1-sst relative expression to the normal level of Bam at 21 after anthesis using LSD test. بررسی بیان ژن 6-sft مربوط به آنزیم ساکارز-فروکتان 6- فروکتوزیل ترانسفراز: بر اساس نتایج بدست آمده در روز 21 پس از گلدهي اثر تيمار شوري در هيچ یک از دو رقم معنيدار نبود )شكل 2 ( ولي پاسخ متفاوت ارقام به شوري باعث شد تا ميزان بيان در رقم قدس تحت شرایط تنش به طور معنيداري كمتر از رقم بم به دست آید. در مطالعه انجام شده بر روي گندم در تنش خشكي انتهاي فصل بيشترین فعاليت آنزیمهاي دخيل در بيوسنتز فروكتان در هفته اول پس از گلدهي اتفاق افتاد و پس از آن روند تغييرات نزولي بود )2004 al.,.)yang et در شرایط مطالعه حاضر این احتمال وجود دارد كه شروع افزایش بيان در این ژن زودتر اتفاق افتاده باشد و در زمان اندازهگيري )روز 21 پس از گلدهي( بيان ژن روند كاهشي را طي كند. شکل 2 - مقایسه میانگین بیان ژن ارقام بم و قدس در تیمار شوری. نسبت 6-sft به شاهد رقم متحمل 21 بم در روز پس از گلدهی بین Figure 2- Mean comparison of 6-sft relative expression to the normal level of Bam at 21 after anthesis between Bam and Ghods varieties under salt stress. 78
شربتخواری و همکاران 3131 بررسی بیان ژن مربوط به آنزیم فروکتوزیل اگزوهیدروالز: اعمال شوري از شروع گلدهي منجر به افزایش قابل توجهي در ميزان بيان در روز 21 پس از گلدهي در رقم متحمل بم شد در حاليكه در رقم قدس تغيير معنيداري مشاهده نگردید. با توجه به نتایج مقایسه ميانگين )جدول 3 ( ميزان انتقال مجدد فروكتان طي شوري به طور معنيداري در بم افزایش و در قدس كاهش یافت. در تنش شوري همبستگي مثبت و معنيداري بين انتقال مجدد فروكتان و بيان ژن مشاهده شد )3/51 >p(. 3/35 بر اساس نتایج محققين دیگر نيز بين ميزان بيان با غلظت كربوهيدرات محلول و كارایي انتقال مجدد رابطه پایداري وجود داشت به این معني كه در مطالعات مختلف با شرایط متفاوت افزایش بيان این ژن با كاهش فروكتان و افزایش انتقال مجدد همراه ميباشد و مشخص شد كه ميزان بيان این ژن طي تنش خشكي در رقم وستونيا با انتقال مجدد باال افزایش قابل توجهي نسبت به رقم كاز با انتقال مجدد پایين داشت.)Zhang et al., 2009( فروكتان همزمان با افزایش بيان القاي انتقال مجدد ساقه طي شوري در رقم بم نشان ميدهد)شكل 3 ( در زمان افزایش تقاضا براي پر شدن دانهها و محدودیت ساكارز افزایش فعاليت فروكتان اگزوهيدروالز ميتواند منجر به شكسته شدن فروكتان و آزاد سازي فروكتوز و ساكارز شود. طي بررسي ميزان فعاليت این آنزیم تحت تنش خشكي در گندم و نمونه برداري از ساقه از مرحله گلدهي با فواصل زماني 3 روزه تا مرحله بلوغ فيزیولوژیک مشخص شد ميزان فعاليت آنزیم طي پر FEH شدن دانهها افزایش ميیابد و طي شرایط تنش در 21 روز پس از گلدهي به حداكثر ميرسد كه در مقایسه با حالت نرمال زودتر اتفاق ميافتد.)Yang et al., 2004( شکل 3 - بیان ژن میانگین مقایسه 78 نسبت به شاهد رقم بم 21 در روز آزمون.LSD پس از گلدهی به روش Figure 3- Mean comparison of relative expression to the normal level of Bam at 21 after anthesis using LSD test.
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131( به نظر ميرسد توان باالتر رقم بم در انتقال مجدد ذخایر ساقه در تنش شوري )جدول 3( با بيان باالتر ژن مرتبط بوده و پتانسيل باالتر این رقم را در استفاده از ذخایر فروكتان ساقه در توليد عملكرد دانه آشكار ميسازد درحاليكه در رقم قدس با انتقال مجدد پایين )جدول 3 ( افزایش مشاهده شده در بيان ژن معنيدار نبود. براساس مطالعه طي شوري Zhang et al. ميزان بيان )2009( با مقدار قند محلول ساقه همبستگي منفي داشت و بيان باالي این ژن به عنوان شاخصي براي كارایي باالي انتقال مجدد قند محلول معرفي شد. در تيمار شاهد ميزان بيان در هر دو رقم مشابه بود ولي رقم قدس احتماال به دليل داشتن مقدار باالتر فروكتان ساقه از حداكثر فعاليت آنزیمي خود براي تجزیه و انتقال مجدد استفاده نموده در حاليكه تحت شرایط تنش توانایي تنظيم افزایشي این ژن را نداشته و احتماال به دليل محدود كننده بودن سایر عوامل دخيل ظرفيت انتقال مجدد آن محدود شده است. درصورتيكه افزایش بيان در رقم بم در تيمار تنش به همراه فراهم بودن سایر عوامل افزایش انتقال مجدد آن شده منجر به دخيل است. بررسی بیان ژن اینورتاز واکوئلی )ivr( در ساقه: نتایج مربوط به تيمارهاي شاهد و شوري از مرحله گلدهي نشان داد در تيمار شوري ميزان بيان اینورتاز در ساقه در هر دو رقم نسبت به شاهد در 21 روز پس از گلدهي افزایش یافت. در شكل افزایش بيان اینورتاز در ميانگرههاي حاوي غالف برگ نشان داده شده است. ميزان این افزایش در رقم بم /3 برابر حالت نرمال و در قدس 2/5 برابر حالت نرمال بوده است. در این زمان تجزیه فروكتان و انتقال كربوهيدرات تجمع یافته در ساقه اهميت پيدا ميكند كه با كاهش قند محلول فروكتان در ساقه همراه ميباشد. اینورتاز سرعت انتقال كربوهيدرات به اندام مقصد را با تجزیه ساكارز كنترل مي كند 2000( al.,.)kim et تجمع هگزوزها طي تنش شوري در ساقه بم به طور معنيداري باالتر از قدس بود )جدول 3(. احتمال دارد هگزوزهاي توليد شده در رقم قدس بالفاصله در مسيرهاي متابوليكي مورد استفاده قرار گرفته و یا تنظيمات پس از رونویسي یا ترجمه به نحوي بوده كه منجر به افزایش فعاليت آنزیم و توليد قندهاي هگزوز در این رقم نشده است. در اینورتازهاي مهارشونده با قند عناصر پایيندست ژن احتماال در تغيير شكل سریع mrna نقش داشته و منجر به تنظيمات پس از رونویسي ميشوند 2007( al.,.)huang et در مطالعه اثر خشكي بر ذرت نيز بيان ژن اینورتاز واكوئلي در ریشه تحت تنش خشكي افزایش یافت درحاليكه فعاليت اینورتاز واكوئلي تغييري نكرد )2000 al.,.)kim et در مطالعات بعدي علت این امر وجود یک مهاركننده پروتئيني گزارش شد كه در تنظيم پس از ترجمه اینورتاز واكوئلي و اینورتاز دیواره سلولي دخالت دارد ivr در رابطه با بيان ژن.)Jin et al., )2009 در 78
شربتخواری و همکاران 3131 ساقه گندم طي دوره پر شدن دانه تاكنون مطالعه اي انجام نشده ولي در بررسي فعاليت اینورتاز طي تنش خشكي انتهاي فصل در گندم فعاليت آنزیم پس از یک كاهش اوليه در هفته اول پس از گلدهي در تيمار خشكي تا 21 الي 2 روز پس از گلدهي افزایش یافت و طي دوره پر شدن دانه به حداكثر رسيد Joudi, ; Yang et al., 2004(.)2009 شکل 4 - مقایسه میانگین ivr بیان ژن نسبت به شاهد رقم بم 21 در روز آزمون.LSD پس از گلدهی با استفاده از Figure 4- Mean comparison of ivr relative expression to the normal level of Bam at 21 after anthesis at 21 after anthesis using LSD test. بررسی بیان ژن مربوط به پروتئین sut1 ساکارز ترانسپرتر: بر اساس نتایج به دست آمده ميزان بيان این ژن در ساقه در روز 21 پس از گلدهي در هيچ یک از دو رقم قدس و بم تغيير معنيداري نداشت. بر اساس مطالعات انجام شده بر روي بيان این ژن در ساقه برنج طي دوره رشد رویشي حداكثر بيان این ژن در اندامهاي رویشي روز قبل از خروج خوشه در اندام هاي منبع )برگ و ساقه( گزارش شده است Furbank et ( )al., 2001 ولي در مورد چگونگي تغييرات بيان این ژن در ساقه گندم طي رشد زایشي مطالعهاي انجام نشده و احتمال دارد تغييرات بيان این ژن قبل از دوره رشد سریع دانه انجام شده باشد. درعينحال به نظر ميرسد به دليل نقش كليدي این ژن در توليد ناقل ساكارز به عنوان مهمترین قند انتقال یابنده در گياه ميزان بيان این ژن در هر دو رقم مورد بررسي در سطح مشابهي قرار داشته است. بررسي بيان ژن sut1 در بذر نشان داد طي شرایط تنش ميزان بيان در هر دو رقم افزایش معنيداري داشت و ميزان بيان در بم به طور معنيداري باالتر بود )شكل 5(. با توجه به اینكه sut1 ژن در بافتهاي مختلف مانند ساقه برگ و بذر بيان شده و به طور غير اختصاصي در انتقال ساكارز از داخل به خارج سلول و یا اندامک واكوئل و بالعكس نقش دارد ( Aoki et al., )2004; Aoki et al., 2007 در زمان پر شدن دانه كه انتقال ساكارز به دانه مهمترین اتفاق سلولي است افزایش بيان آن در بذر احتماال با مرحله 77
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131(.)Paknejad et al., 2007( رشد سریع دانه ارتباط داشته باشد. ژن به sut1 ميزان باالیي در بذر در غشاي پالسمایي الیه آلورون كه اندوسپرم را احاطه كرده بيان شده و منجر به انتقال آسيميالتها به دانههاي در حال پر شدن ميگردد و بر اساس تحقيقات انجام شده حداكثر بيان آن در دانه برنج 13 تا 23 روز پس از گلدهي گزارش شده است ( al., Furbank et.)2001 تحت شرایط تنش افزایش سرعت پر شدن دانه به عنوان یک سازوكار دفاعي براي توليد هر چه سریعتر دانه اتفاق ميافتد افزایش بيان sut1 به نظر ميرسد در هر دو رقم مورد بررسي تحت تنش شوري ميتواند در این راستا نقش موثري ایفا كند. افزایش بيان این ژن در بذر تحت شرایط تنش با مقدار ساكارز ساقه همبستگي منفي.)p< داشت 3/25( 3/35 بيان باالتر این ژن در رقم بم در هر دو تيمار شاهد و تنش حاكي از توانمندي ذاتي این رقم در انتقال سریعتر ساكارز به آندوسپرم دانههاي در حال تشكيل در مقایسه با رقم قدس ميباشد. شکل 5- مقایسه میانگین استفاده از آزمون.LSD بیان ژنsut1 بذر نسبت به شاهد رقم متحمل بم در روز 21 پس از گلدهی با Figure 5- Mean comparison of seed sut1 expression relative to normal level of Bam at 21 after anthesis using LSD test. ivr نتيجه گيري كلي بر اساس آزمایشات انجام شده رقم متحمل بم توانایي باالیي در تغيير الگوي بيان ژنهاي بيوسنتز كننده و تجزیه كننده فروكتان ساقه تحت تنش شوري دارد. افزایش بيان ژنهاي و كه در تجزیه فروكتان ساقه دخالت دارند باعث شد تا طي شوري ذخایر فروكتان موجود در ساقه در مرحله پر شدن و رشد سریع دانهها مورد استفاده گياه قرار گيرد. به نظر ميرسد تغيير الگوي بيان ژنهاي دخيل در متابوليسم فروكتان و 76
شربتخواری و همکاران 3131 در نتيجه انتقال مجدد باالي این ذخایر تحت تنش شوري یكي از علل موفقيت بم به عنوان رقم متحمل به شوري باشد. سپاسگزاری بدین وسيله نویسندگان مراتب تشكر خود را از پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي ایران به دليل فراهم آوردن امكانات مالي و اجرایي این پروژه )شماره مصوب: 5-35-35-83112( ابراز ميدارند. Aoki N, Scofield GN, Hirose T, Furbank RT (2007). Involvement of the sucrose transporter, OsSUT1, in the long-distance pathway for assimilate transport in rice. Journal of Experimental Botany 58: 3155-3169. Aoki N, Scofield GN, Wang XD, Patrick JW, Offler CE, Furbank RT (2004). Expression and localisation analysis of the wheat sucrose transporter TaSUT1 in vegetative tissues. Planta 219: 176-184. Blum A (1998). Improving wheat grain filling under stress by stem reserve mobilisation. Euphytica 100: 77-83. Bates LS, Waldern RP, Teare I D (1973). Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil 39: 205-208. Chomczynski P, Sacchi N (1987). Single step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanat phenol- chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159. Dhanda SS, and Sethi GS (1998). Inheritance of excised-leaf water loss and relative water content in bread wheat (Triticum aestivum). Euphytica 104: 39-47. Ehdaie B, Alloush GA, Madore MA, Waines JG (2006). Genotypic variation for stem reserves and mobilization in wheat: I. Postanthesis changes in internode dry matter. Crop Science 46: 735-746. Furbank RT, Scofield GN, Hirose T, Wang XD, Patrick JW, Offler CE (2001). Cellular OsSUT1 in developing rice grains. Australian Journal of Plant Physiology 28: 1187-1196. Hasegawa PM, Bressan RA, Zhu K, Bohnert HJ (2000). Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 51: 463-99. Hisano H, Kanazawa A, Kawakami A, Yoshida M, Shimamoto Y, Yamada T (2004). Transgenic perennial ryegrass plants expressing wheat fructosyltransferase genes accumulate increased amounts of fructan and acquire increased tolerance on a cellular level to freezing. Plant Science 167: 861-868. Huang LF, Bocock PN, Davis JM, Koch KE (2007). Regulation of invertase: a suite of transcriptional and post-transcriptional mechanisms. Functional Plant Biology 34: 499-507. Jenks MA, Hasegawa PM, and Jain SM (2007). Advances in Molecular Breeding Toward Drought and Salt Tolerant Crops. Springer. The Netherlands. Jin Y, Ni DA, and Ruan YL (2009). Posttranslational Elevation of Cell Wall Invertase Activity by Silencing Its Inhibitor in Tomato Delays Leaf Senescence and Increases Seed Weight and Fruit Hexose Level. Plant Cell 21: 2072-2089. منابع 77
مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره 6 شماره 2 تابستان 3131( Joudi M, (2009). Study on reservation capacity and carbohydrate remobilization in Iranian wheat varieties. Ph.D. Thesis. Agronomy and plant breeding department. Tehran university. Tehran. Iran (In Farsi). Joudi M, Ahmadi A, Mohamadi V, Abbasi A, Vergauwen R, Mohammadi H, Van den Ende W (2012). Comparison of fructan dynamics in two wheat cultivars with different capacities of accumulation and remobilization under drought stress. Physiologia Plantarum 144: 1-12. Karim MA, Nawata E, Shigenaga S (1993). Effect of salinity and temperature on yield, mineral ion concentrations and physiology in hexaploid triticale (X Triticosecale Wittmack). Japenese Journal of Crop Science 62: 419-428. Kawakami A, Yoshida M (2005). Fructan:fructan 1-fructosyltransferase, a key enzyme for biosynthesis of graminan oligomers in hardened wheat. Planta 223: 90-104. Kerepesi I, Galiba G (2000). Osmotic and Salt Stress-Induced Alteration in Soluble Carbohydrate Content in Wheat Seedlings. Crop Science 40: 482-487. Kim JY, Mahe A, Brangeon J, Prioul JL (2000). A Maize Vacuolar Invertase, IVR2, Is Induced by Water Stress. Organ/Tissue Specificity and Diurnal Modulation of Expression. Plant physiology 124: 71-84. Koch KE (1996). Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47: 509-540. Paknejad F, Magidi A, Noormogammadi GH, Seadat A,Vazan S (2007) Evaluation of drought stress on effective traits at accumulative assimilate of grain in different cultivars of wheat. Journal of agricultural sciences 13: 137-149 (In Farsi). Paolacci AR, Tanzarella A, Porceddu E, Ciaffi M (2009). Identification and validation of reference genes for quantitative RT-PCR normalization in wheat. BMC Molecular Biology 10: 1-27. Pfaffi MW (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT- PCR. Nucleic Acids Research 29, e45. Salekdeh GH, Siopongco J, Wade LJ, Ghareyazie B, Bennett J (2002). A proteomics approach to analyzing drought- and salt- responsiveness in rice. Field Crops Research 76: 199-219. Shiratake K (2007). Genetics of sucrose transporter in plants. Genes, genoms and genomics 1: 73-80. Van den Ende W, Clerens S, Vergauwen R, Van Riet L, Van Laere A, Yoshida M, Kawakami A (2003). Fructan 1-exohydrolases. beta-(2,1)-trimmers during graminan biosynthesis in stems of wheat? Purification, characterization, mass mapping, and cloning of two fructan 1-exohydrolase isoforms. Plant physiology. 131: 621-631. Wardlaw AF, Willenbrin kj (2000). Mobilization of fructan reserves and changes in enzyme activities in wheat stems correlate with water stress during kernel filling. New Phytologist 148: 413-422. Xue GP, McIntyre CL, Jenkins CL, Glassop D, Herwaarden AF, Shorter R (2008). Molecular dissection of variation in carbohydrate metabolism related to water-soluble carbohydrate accumulation in stems of wheat. Plant Physiology 146: 441-454. Yang J, Zhang J, Wang Z, Zhu Q, Liu L (2004). Activities of fructan- and sucrosemetabolizing enzymes in wheat stems subjected to water stress during grain filling. Planta 220: 331-343. Zhang J, Dell B, Conocono E, Waters I, Setter T, Appels R (2009). Water deficits in wheat: fructan exohydrolase (1-FEH) mrna expression and relationship to soluble carbohydrate concentrations in two varieties. New Phytologist 181: 843-850. 77
شربتخواری و همکاران 3131 Expression analysis of the key genes of fructan remobilization and some physiological traits in wheat under terminal salinity Sharbatkhari M. 1, Shobbar Z.S. 2, Galeshi S. 3, Soltani A. 4, Nakhoda B. 5 1 PhD Student, Agronomy Dept., Gorgan University of Agricultural sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran. 2,5 Assistant Professor, Molecular Physiology Dept., Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Karaj, Iran. 3,4 Professor, Agronomy Dept., Gorgan University of Agricultural sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran. Abstract Remobilization of water soluble carbohydrates of wheat stem especially fructan play an important role in grain filling and yield production under stress. To study the effect of salt stress on the key genes involved in this mechanism, 1-sst and 6-sft genes contributed in fructan biosynthesis, and ivr genes involved in degradation of fructan and sucrose, respectively, and sut1 as a sucrose transporter gene were examined in Bam as salt-tolerant and Ghods as salt-sensitive varieties using Real-Time PCR. Salt stress was applied since anthesis by irrigation water with EC of 15dSm -1. The experiment was done in greenhouse with three replicates using completely randomized design with factorial arrangement. Sampling was done for stem fructan content at five points with 7-day intervals during seedfilling period and for measurement of prolin and relative water content (RWC( from leaf and gene analysis from stem and seed at day 21 after anthesis. Fructan remobilization was estimated by subtraction of maximum and minimum of fructan content. Results showed that salt stress had a significant influence on RWC and prolin content and induced fructan remobilization along with the stem 1-sst, and ivr genes as well as seed sut1 gene in Bam. There was a significant positive correlation between the and ivr expression and fructan remobilization under salinity. Based on the obtained results, Bam had higher capacity to hydrolase and remobilize fructan by up-regulation of the critical genes during seed filling, so it was more efficient to use stem reserve carbohydrates and produced higher grain yield under salt stress. Keywords: terminal salinity, fructan remobilization, gene expression. Corresponding Author: Shobbar Z.S. Tel: 026-32703536 E-mail: shobbar@abrii.ac.ir 78